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    臨床微生物檢驗的現狀和對策
    雙擊自動滾屏 發布者:admin        發布時間:2010/2/23        閱讀:14108

    臨床微生物檢驗的現狀和對策

    山西亞森實業有限公司   郭永紅

    臨床微生物檢驗側重對感染性疾病作出快速準確的診斷,應密切與臨床相結合,以控制和消滅感染性疾病,以達到保障和提高人類健康水平的目的。目前我國與國外還存在著很大差距,離臨床對我們的要求還很遠。本人對此提出一些看法,希望能對臨床日常的工作起到一定的幫助作用。

    一、目前現狀

    1.新的病原體及其所致的感染性疾病不斷出現。臨床微生物學受到重大挑戰之一是出現了許多新病原體引起的新傳染病。人們對新傳染病的認識和準備不足,缺乏有效的預防、診斷和治療措施,人群無免疫力,因此來勢兇、傳播快、范圍廣、傳播途徑多,往往造成巨大的經濟損失和社會影響,如O157出血性腸炎、瘋牛病、O139霍亂、艾滋病、埃博拉出血熱、新型肝炎病毒、埃立克體和肺炎衣原體感染、萊姆病、腸病毒71、手足口病、SARS等等,均在世界不同的地區和范圍內造成巨大的損失和影響。

    2.許多傳統的老病原體出現了臨床新問題,對實驗診斷提出了新的要求。近10年來,全球結核病形勢急劇惡化,據世界衛生組織估計,全球已有20億人受到結核菌的感染,現有結核病人約2000萬,結核已成為傳染病的頭號殺手。念珠菌感染逐年增多,念珠菌感染成了人類又一主要殺手,特別是在引起醫院感染的病原菌中具有重要地位,外傷、燒傷、營養不良,器官移植,糖尿病,腎功能衰竭,血液病,粒細胞減少,以及長期大量應用抗菌藥物治療的患者更易出現念珠菌感染。念珠菌血癥的患者死亡率在25%~57%(平均為38%),因此,念珠菌感染的早期診斷和及時治療成為一項極為緊迫的任務。性病死灰復燃等等。

    3.新老病原體的耐藥性明顯增強。不僅帶來治療上的困難,也向實驗診斷提出了挑戰。我國是世界上濫用抗生素最為嚴重的國家之一。耐藥菌引起的醫院感染人數,已占到住院感染患者人數的30%左右。2005516健康報以“全耐藥細菌露臉再敲警鐘”報道了福建泉洲市第一醫院檢驗科從一男性19歲腎結石術后患者尿液中分離出一株致病菌,經細菌鑒定為短穩桿菌,三次重復其體外藥敏,結果均為全部耐藥。此前國際上已出現了耐全部常用藥物的細菌,稱之為“全耐藥細菌”。全耐藥細菌在我國的出現,這無疑是一個危險的信號。抗菌藥物的廣泛使用,導致了一系列的副作用,在此前我們關注更多的是抗菌藥物濫用會使身體器官受損,而現在另一個更為嚴峻的問題又在向我們逼近,這就是因濫用抗生素而破壞體內正常菌群,最終使病菌耐藥性增強而導致疾病無藥可治。當前細菌的耐藥性問題主要集中在以下6方面,如耐苯唑西林、并對萬古霉素敏感性降低葡萄球菌(MRSA)、耐青霉素和多重耐藥的肺炎鏈球菌(PRP)、耐萬古霉素的腸球菌(VRE)、產生超廣譜β內酰胺酶(ESBL)的肺炎克雷伯菌和大腸艾希氏菌、持續高產染色體I型酶的陰溝、產氣腸桿菌和弗勞地枸椽酸桿菌等細菌以及多重耐藥的銅綠假單胞菌、嗜麥芽窄食單胞菌和不動桿菌。多重耐藥菌株的出現可導致抗感染治療失敗、造成患者往院天數延長、醫療費用增加和死亡率的上升,使臨床抗感染治療遇到前所未有的困難。

    二、微生物學檢驗標本采集、運送、驗收和處理注意事項
    1.原則

    (1)標本采集
      1)申請單標記必須清楚(姓名、性別、年齡、病歷號、臨床診斷、標本來源、采集時間、檢查項目、抗生素應用情況等),以便實驗室能夠合理選擇培養環境和培養基;
      2)盡量在抗生素應用前采集標本,以避免漏檢和提高陽性檢出率;
      3)標本采集應嚴格執行無菌操作;
      4)咽拭、肛拭、傷口拭子等拭子標本,應插入運送培養基送檢;
      5)痰、尿液、傷口拭子等混有正常菌群的標本,不可放入肉湯培養基內送檢;

    6)采集標本的容器必須經滅菌處理,但不可用消毒劑。
    (2).標本運送
     1
    )標本采集后應盡快送到微生物實驗室;

    2)標本采集后在室溫下超過2h未送達實驗室,可視為不合格標本。
    3).標本驗收
     1
    )實驗室只能接受和處理合格標本;
     
    2)實驗室對不合格標本退回必須說明原因,并應及時與臨床聯系。
    4).處理

    根據檢驗目的結合臨床資料選擇合適的培養基接種標本;抗菌藥物治療的標本,必要時應加入某些物質以中和藥物對細菌的抑制作用。

    2.微生物學檢驗標本的采集和處理

    (1)尿液標本采集和處理

    中段尿標本:中段尿培養結果往往和臨床不符,其原因,一是病人未經消毒,直接留取標本,二是尿液不做細菌計數,而以培養結果為準,因而造成假陽性;三是尿液標本未能及時送到實驗室,尿液中營養物質豐富,使得污染菌大量繁殖,造成細菌菌數假性增高,致使得出錯誤的病原學診斷。
      通常留取晨起第一次尿液(此時尿液在膀胱內儲存4小時以上);尿液采集后要及時送檢,并保證2小時內接種;不能及時送檢和接種時,尿液應置4-8冰箱保存;冷藏標本應于8小時內接種;懷疑沙門氏菌感染時,應于發病2周左右采集尿液,懷疑鉤端螺旋體感染時,應于發病后2小時采集尿液,上述時間陽性率高。

    尿液微生物學檢驗標本采集方法如下:

    1)中段尿采集法:成年男性和女性分別用肥皂水清洗尿道口和外陰部,再用滅菌水沖洗尿道口,然后排尿棄去前段尿液,于帶蓋的無菌盛器中留取中段尿液510ml
      2)導尿法:用導尿管導取1015ml尿液,置滅菌容器中送檢;長期留置導尿管者應更換新導尿管留尿;留置導尿時,用無菌消毒法消毒導尿管外部及導尿管口,用無菌注射器通過導尿管抽取尿液送檢(不可采集尿液收集袋中的尿液送檢);

      3)集尿法:懷疑結核分枝桿菌感染時,于清潔盛器中留取24小時尿液,取其沉渣1015ml送檢;
      4)恥骨上膀胱穿刺法:培養結果與臨床病情矛盾時可采用此法,一般較少應用;
      5)腎盂尿采集法:必須由臨床醫生采集。
      (2)糞便標本采集和處理

    1)采集時間:①腹瀉患者于急性期,盡量在用藥前采集糞便;②傷寒患者于發病2w以后采集糞便;③懷疑霍亂時立即采集糞便送檢。
      2)采集方法:①自然排便:取新鮮糞便的粘液、膿血或絮狀物等有意義成分,2-3g1-2ml,盛無菌容器內或置于保存液或增菌液內送檢;②直腸拭子:用于難以獲得糞便或排便困難的患者和嬰幼兒,標本采集后插入滅菌試管內送檢。
      3)痰及下呼吸道標本采集和處理

    由于痰標本絕大多數仍以自然咳痰方式采取,因而易受上呼吸道分泌物污染,據報道臨床所留痰標本50%為唾液,25%為唾液和痰的混合物,25%為真正的痰標本,因此,確定痰標本的質量非常重要。符合要求的痰標本應在低倍鏡視野鏡中≤10個鱗狀上皮細胞,以及≥25個白細胞。

    1)自然咳痰法:①晨痰為佳;②先冷開水漱口清潔口腔和牙齒;③彎腰90°,用力咳出呼吸道深部的痰;④痰量不得少于1ml;⑤痰咳出困難時可先霧化吸入NaCl溶液(100g/L,加溫到45)使痰容易咳出。
      2)小兒取痰法:用彎壓舌板向后壓舌,將拭子深入咽部,小兒因壓舌板刺激引起咳嗽,噴出的肺或氣管分泌物粘在拭子上可送檢。
      3)支氣管鏡、支氣管穿刺、支氣管肺胞灌洗等采集法:此采集方法必須由醫生操作。

    4)血液及骨髓培養標本

    1)抗生素治療前,嚴格無菌靜脈采血810ml(兒童14ml);

    2)無菌注入專用培養瓶(成人、兒童、需氧菌、厭氧菌、L型菌不同培養瓶)中送檢;

    3)如已用抗生素不能停用時,可于48h內分別于下次用抗生素之前,采取6份血液標本送檢;
        4
    )必要時可需氧菌、厭氧菌(占10%)和L型菌同時培養;
        5
    )疑為心內膜炎時,為提高陽性檢出率,可酌情不同部位、不同時間,多次采血或動脈采血進行培養;
        6
    )必要時可取骨髓12ml,無菌注入專用培養瓶中送檢
        5
    )腦脊液培養標本
       
    采集時間:懷疑腦膜炎時應立即采集腦脊液,最好在應用抗生素之前采集腦脊液。
       
    采集方法:無菌腰穿采集腦脊液35ml,分裝到3個無菌小瓶中(各12ml)。用于細菌和病毒檢測時腦脊液量不少于1ml;用于真菌和抗酸桿菌檢測腦脊液量不少于2ml

    6)穿刺液培養標本包括胸水、腹水、心包液、關節液、鞘膜液等穿刺液培養標本。

    采集時間:一般在用抗生素等抗菌藥物治療之前,或在停止使用抗菌藥物之后2-3d采集標本。
       
    采集方法:①無菌操作穿刺抽取標本或外科手術采集標本;②標本采集量應>1ml(結核分枝桿菌培養時應為15ml);③標本采集后注入無菌小瓶或無菌試管中送檢;④可在盛器中先加入滅菌肝素然后再加入穿刺液,以防止穿刺液凝固(0.5ml肝素可抗凝5ml標本。

    7)胃液及膽汁培養標本

    抽取空腹胃液5ml,置無菌管內送檢;膽汁培養標本由十二指腸引流法或膽囊穿刺法或手術中留取膽汁,采集膽汁量為5ml,置無菌管內送檢;胃液和膽汁采集后必須立即送檢。
      
    8)膿汁和病灶分泌物培養標本

    膿及分泌物標本,取材不好往往培養出多種細菌,少則2~3種,多則6~7種,實際這些細菌并非引起感染的真正原因,而多是在創面上生長的雜菌,因此一定要采深部分泌物,必要時采取創面和健康部位過渡地段的少量組織進行培養。

    采集前局部消毒,然后無菌采取膿汁或病灶分泌物或組織。標本采集后立即置無菌管內送檢。

    9)眼...咽拭子培養標本用拭子常規采集各種標本。標本采集過程中應注意避免被粘膜上的正常菌群污染,標本采集后連同拭子一起置無菌管內送檢。
      
    10)泌尿生殖道培養標本

    1)尿道分泌物:清洗尿道口采取尿道口溢出的膿性等分泌物,或用無菌拭子插入尿道24cm處輕輕轉動后取出,置無菌試管中送檢。
        2
    )陰道、宮頸分泌物:通過陰道擴張器,用滅菌拭子采取陰道口或宮頸管12cm處分泌物,置無菌試管中送檢。
        3
    )宮腔分泌物:在必要時用外套保護膜的滅菌導管抽取。
        4
    )前列腺液:清洗尿道口沖洗膀胱后用前列腺按摩法采取前列腺液送檢。
        5
    )精液:受檢者應5d未排精,清洗尿道口后手淫或體外排精法,射精于無菌容器內送檢。
        6
    )潰瘍分泌物:滅菌生理鹽水溶液清洗患處,用無菌拭子取其邊緣或基底部的分泌物,置無菌試管中送檢。
       
    11)燒傷感染培養標本
       
    燒傷12h后用無菌棉拭子無菌操作采集標本;要注意從多個創面取樣;燒傷嚴重感染時易發生敗血癥,創面取樣的同時應該采集血樣送做血培養(最好同時做需氧菌培養和厭氧菌培養)。
        12
    )厭氧菌感染培養標本
       
    標本采集①要注意避免標本污染和與空氣接觸,嚴格遵守無菌操作;②用注射器抽取胸水、腹水、心包液、關節液、膽汁、腦脊液或無菌手術抽出膿液;③抽出液體標本后,要盡快排除注射器內的空氣。
       
    標本運送①標本采集后不得冰箱儲存,必須盡快(半小時內)送實驗室;②運送方法:a注射器運送(標本抽取后盡快排除空氣)或接種到專門的運送培養基中直接運送;b含運送培養基的無氧小瓶運送;c厭氧罐運送(組織塊);d 大量液體標本運送時要裝滿標本瓶并立即驅氧,加蓋運送;e一般不采用棉拭子法。
        13
    )真菌感染培養標本
       
    淺部真菌感染標本采集①皮膚:常規消毒皮膚,從皮膚癬菌皮損邊緣刮取鱗屑,置無菌平皿內送檢;皮膚潰瘍則采集病損邊緣膿汁或組織;②指(趾)指甲:消毒指(趾)指甲并去掉其表面部分,取可疑病變部分,用刀片修成小薄片56片,置無菌容器內送檢;③毛發:采集根部斷折處,至少56根送檢。
       
    深部真菌感染標本采集①血液:無菌采血810ml,注入未用過抗生素的或可中和抗生素的血培養瓶中,立刻送檢;如不能立刻送檢時血培養瓶應放室溫,但不可超過89h;②腦脊液:采樣量不少于35ml,分別注入兩支無菌試管中送檢(一管做真菌培養和墨汁染色;一管測隱球菌抗原和其他培養);③呼吸道及泌尿生殖道深部真菌感染標本采集同一般細菌培養標本。
    三、標本直接制片染色顯微鏡下觀察

    在臨床微生物學檢驗工作中更重要體現在標本直接制片染色顯微鏡下觀察,對于感染性疾病病原體的診斷有重要的意義。痰標本涂片中的白細胞數和鱗狀上皮細胞數決定了這個標本是否做培養。同時,菌體形態及是否在白細胞內等信息為痰標本培養出的微生物是否為致病菌提供了重要線索。各種標本的抗酸染色是分枝桿菌感染診斷的重要經典方法。引起急性腹瀉細菌從致病機理上分為兩類,產毒素性細菌和組織侵襲性細菌。糞便標本直接染色鏡檢找到大量多核白細胞,提示組織侵襲性致病菌感染,如果腸道菌群紊亂腹瀉革蘭染色結果可以提示是酵母菌或者是葡萄球菌引起的,水樣糞便標本暗視野觀察穿梭運動,如果抑動試驗陽性,對于霍亂快速診斷有很重要價值。如果腦脊液標本墨汁涂片見有厚莢膜圓形酵母樣菌體,給新型隱球菌腦膜炎提供了快速的診斷方法。陰道分泌物涂片,革蘭染色對于陰道炎和細菌性陰道病的診斷及其重要,現已有標準方法通過革蘭染色涂片診斷細菌性陰道病。泌尿生殖道標本涂片中見到典型腎形的革蘭陰性雙球菌分布于白細胞內外,可診斷為淋病。

    標本直接制片染色顯微鏡下觀察對檢出病原微生物有很重要的意義,一是可以判斷標本是否合格;二是可以對一些特殊標本馬上進行電話報告;三是選擇合適的培養基進行分離培養或增菌;四是可對分離出的微生物與原始的涂片進行比較。

    四、細菌的分離與接種 

    培養細菌時,根據實際情況須將標本接種于不同培養基上,有些標本還需要先增菌在再接種于不同的培養基上。常用方法為平板劃線接種法。通過平板劃線后,可使細菌分散生長,形成單個菌落,有利于從含有多種細菌的標本中分離出目的菌。分離培養用的平板培養基應表面干燥,可于臨用前置35孵育箱內30分鐘,這樣表面即干燥有利于分離培養,又使培養基預溫,對培養某些較嬌弱的細菌有利。常用的平板劃線接種法有以下幾種。

    1. 分區劃線法 此法多用于膿汁、糞便等含菌量較多的標本的分離。其方法是首先將接種環滅菌后,沾取標本均勻涂布于平板培養基邊緣一小部分(第一區),將接種環火焰滅菌,待冷卻后只通過第一區34次后連續劃線(為第二區),依次可共劃線35區,每一區細菌數可逐漸減少,直到分離出單個菌落為止。

    2. 連續劃線法 該法多用于含菌數量較少的標本。其方法是首先用白金耳將標本均勻涂布于平板培養基邊緣一小部分,然后由此開始,在培養基表面自左向右連續劃線并逐漸向下移動,直到下邊緣。

    劃線接種時,盡可能作到直、密、勻,有效地利用培養基表面達到充分分離的目的。如果標本含菌較多,接種在強選擇培養基(如SS瓊脂)上時或標本含菌較少時,采用分區劃線法接種,接種環可一直劃完各區皿內,中間不必滅菌。

    五、細菌的培養方法

    根據培養細菌的目的和培養物的特性,培養方法分為一般培養法、二氧化碳培養法和厭氧培養法三種。

    六、臨床微生物的分類方法

    1.生理學與生化學分類法

         細菌的形態、染色以及特殊結構是最早的分類依據,方法有傳統分類法和數值分類法兩種。

    1).傳統分類法 19世紀以來,以形態生理特征為依據選擇穩定的生物學性狀,如形態結構、染色性、培養特性、生化反應、抗原性作為分類依據,然后按主次順序逐級區分。使用方便,分類亦明確,但有主觀性。

    2).數值分類法  20世紀60年代,隨計算機的應用而發展的分類方法。它對各種生物學性狀按等重要原則進行分類,選用50項以上的生理生化指標進行比較,分析相似度,劃分屬和種,并確定親緣關系。

    2.遺傳學分類法

    遺傳學分類是以細菌的核酸、蛋白質等組成的同源程度分類。該分類法的優點是:①對細菌的有較為一致的概念;②使分類不會出現根本性的變化;③可制定可靠的細菌鑒定方案;④有利于了解進化和親緣關系。

    1).DNAG+C mol%測定 

         DNA分子兩條鏈上4種堿基的總分子量為100,測定其中G+CAT摩爾百分比,能反映出細菌間DNA分子同源程度,習慣上以G+C作為細菌分類標記。不同菌屬間的G+C mol%范圍很大,在25—75%之間,但同一種細菌G+C mol%相當穩定,不受菌齡、培養條件和其他外界因素影響,親緣關系越近的細菌,它們G+C mol%越相近。

    2).核酸同源值測定

    利用DNA分子雜交技術測定DNA分子的相似度。其步驟是先提取DNA,加熱變性解鏈,然后將兩種變性的DNA(其中一種為標記DNArRNA)混合液在一定的溫度下保溫復性,重新得到雜交的雙螺旋DNA分子,鑒定其雙螺旋結合率。結合率大小反映DNA堿基序列相似程度和菌種間的親緣關系。同一菌的結合率為100%,80—90%的同源為同種內、同亞種的細菌,60-70%的同源性為同種內不同亞種的細菌,20-60%則認為是同屬中的不同菌種。

    3).核蛋白體RNA堿基序列測定

    細菌核蛋白體RNA序列比較保守,變化十分緩慢。分離提取細菌16SrRNA,用T1核酸酶消化,分析寡核苷酸的堿基序列可測出rRNA的相關性。繪制各類群關系和樹狀譜,從而確定種系的發生關系

    七、臨床微生物的分類依據

         1. 形態特征
        
    (1)個體形態 鏡檢細胞形狀、大小、排列,革蘭染色反應,運動性,鞭毛位置、數目,芽孢有無、形狀和部位,莢膜,細胞內含物;放線菌和真菌的菌絲結構,孢子絲、孢子囊或孢子穗的形狀和結構,孢子的形狀、大小、顏色及表面特征等。
       
    (2)培養特征
        
    1)在固體培養基平板上的菌落(colony)和斜面上的菌苔(lawn)性狀(形狀、光澤、透明度、顏色、質地等);
         
    2)在半固體培養基中穿刺接種培養的生長情況;
        
    3)在液體培養基中混濁程度,液面有無菌膜、菌環,管底有無絮狀沉淀,培養液顏色 等。
          2.
    生理生化特征
       
    (1)能量代謝 利用光能還是化學能;
       
    (2)對O2的要求 專性好氧、微需氧、兼性厭氧及專性厭氧等;
       
    3 )營養和代謝特性 所需碳源、氮源的種類,有無特殊營養需要,存在的酶的種類等。
          3.
    生態習性
         
    生長溫度,酸堿度,嗜鹽性,致病性,寄生、共生關系等。
          4.
    血清學反應
         
    用已知菌種、型或菌株制成抗血清,然后根據它們與待鑒定微生物是否發生特異性的血清學反應,來確定未知菌種、型或菌株。
         5 . 
    噬菌反應
        菌體的寄生有專一性,在有敏感菌的平板上產生噬菌斑,斑的形狀和大小可作為鑒定的依據;在液體培養中,噬菌體的侵染液由混濁變為澄清。噬菌體寄生的專業性有差別,寄生范圍廣的謂多價噬菌體,能侵染同一屬的多種細菌;單價噬菌體只侵染同一種的細菌;極端專業化的噬菌體甚至只對同一種菌的某一菌株有侵染力,故可尋找適當專化的噬菌體作為鑒定各種細菌的生物試劑。

    六、微生物鑒定

    通過分離培養獲得的病原菌,必須達到不含有其他微生物的純培養,才能進行系統鑒定。系統鑒定就是通過病原菌的形態結構、生長特性、抗原性和病原性等檢測,并用已知標準免疫血清確定分離細菌的屬、種和型。微生物鑒定的程序通常是根據其形態,生長、生化特性等定種,最后根據抗原的免疫血清學檢查定型。

    1.形態學檢查 各種細菌的形態,在適宜的環境下是相對穩定的。但環境的改變,如培養基條件的改變,抗生素和化學藥品的作用等,均可使細菌產生不規則的形態,并可出現細胞壁的缺陷和多樣性。為此,在作細菌形態鑒定時,必須按被檢菌的生長要求,選擇適宜的培養基和培養條件,以及適宜的培養時間和檢查方法,才能作出正確的形態學鑒定。形態學檢查一般包括二方面:肉眼觀察和顯微鏡檢查。

    1.肉眼觀察 肉眼觀察主要觀察細菌在固體、液體、半固體,鑒別培養基上的生長情況。在固體培養基上要觀察菌落形態、大小、顏色是否均勻一致,表面是光滑濕潤,還是干燥無光或呈皺紋狀,邊緣是整齊還是不規則,菌落是隆起、扁平,還是乳頭樣,是透明、半透明或不透明。在液體培養基中,要觀察培養基是否呈均勻渾濁,管底有無沉淀,液面有無菌膜,是否產氣等。在半固體培養基上應觀察細菌是否沿著接種線生長,是呈毛刷樣生長還是均勻生長,上下生長是否一致。在鑒別培養基上,應觀察其生長情況是否與預期的相一致,在血瓊脂培養基上還要觀察是否溶血及溶血環的特點,在某些培養基上還要注意是否有臭味等。

    2. 顯微鏡觀察 在作細菌形態學檢查時,要根據被檢菌的種類和檢查項目,選用相應的染色方法,同時要注意選擇適合的培養基以及細菌培養的時間,才能達到預期的目的。一般以1824小時(生長時間長的細菌除外)的幼嫩培養菌為宜。例如,作革蘭染色檢查時,培養時間長的陳舊細菌,可能由陽性變為陰性。作細菌運動性檢查時,液體培養基的幼嫩培養物(幾小時到十幾小時)最為適宜。作炭疽莢膜染色時,因炭疽桿菌在一般培養基上不形成莢膜,而在動物體內形成明顯的莢膜,因此,應先接種小鼠,取死亡動物的病料作涂片標本鏡檢。作鞭毛染色時,以液體培養基為宜。芽胞的形成,因細菌種類不同,往往對培養條件如培養基、空氣和培養時間等而異,但一般均要求較長時間。鏡檢時除注意其基本形態結構和大小(要用測微計測量)外,還應注意其排列狀態、菌端形狀、有無兩極染色、有無形成芽胞和莢胞等。必要時可用電鏡觀察其微細結構。

    革蘭染色性是細菌鑒定的前提,革蘭染色錯誤肯定對細菌鑒定有影響。即使使用自動化儀器也是如此。同時菌體形態、染色性的觀察可以修正儀器出現的錯誤報告。如形態觀察很容易區別細菌和酵母樣菌,完全可以避免誤報;莫拉菌屬、不動桿菌屬的形態可區分其他常見非發酵的桿菌。革蘭陽性菌或陰性菌、陽性球菌和桿菌,陰性球菌或桿菌決定了對細菌采用何種鑒定系統。傳統方法中對染色性不定的細菌,還可通過進行萬古霉素紙片法敏感試驗和3%KOH拉絲試驗,起到佐證作用。革蘭陽性菌通常對萬古霉素敏感、拉絲試驗陰性;革蘭陰性菌則相反。

    3. 細菌血清型鑒定及血清學試驗

    細菌抗原結構比較復雜,有存在于細胞壁的菌體抗原(O抗原)。有運動性的細菌在菌體抗原之外還有鞭毛抗原(H抗原),它具有不同的種、型特異性。包圍于細胞壁外面的抗原稱表面抗原,它包括種、型特異性很強的莢膜抗原(如炭疽桿菌)以及Vi抗原(沙門氏菌)和K抗原(大腸桿菌)。此外還有存在于某些革蘭氏陰性桿菌表面的菌毛抗原。從抗原的特異性程度可區分為:存在于屬間細菌所共有的共同抗原,這種抗原的存在,只能表明其屬性。另一類抗原為特異性抗原,只存在于特定的種、型,是最后確定細菌種、型的重要依據。

    血清型鑒定是微生物鑒定的特異方法。首先要求鑒定的細菌必須純凈,不能混有其它種細菌,而且要新鮮,細菌要在適宜的條件下培養,盡量減少傳代,以防發生變異。其次是要有特異性強和效價高的已知標準免疫血清(包括單克隆抗體)和標準菌株。有些種類細菌,如大腸桿菌和沙門氏菌不僅種、型繁多,而且抗原構造復雜,應購置專門的分型血清以備應用。最后是根據其菌體構造和抗原成份以及實驗室的設備技術條件,選擇相應的一種或幾種血清學試驗方法進行鑒定。

        4.數碼鑒定法基本原理

    數碼鑒定是指通過數學的編碼技術將細菌的生化反應模式轉換成數學模式,給每種細菌的反應模式賦予一組數碼,建立數據庫或編成檢索本。通過對未知菌進行有關生化試驗并將生化反應結果轉換成數字(編碼),查閱檢索本或數據庫,得到細菌名稱。其基本原理是計算并比較數據庫內每個細菌條目對系統中每個生化反應出現的頻率總和。

    自動化的微生物鑒定分析系統在臨床微生物實驗室的應用,為微生物檢驗工作者對病原菌的快速診斷提供了有力工具。鑒定系統的工作原理因不同的儀器和系統而異。不同的細菌對底物的反應不同是生化反應鑒定細菌的基礎,而試驗結果的準確度取決于鑒定系統配套培養基的制備方法、培養物濃度、孵育條件和結果判定等。大多鑒定系統采用細菌分解底物后反應液中pH的變化,色原性或熒光原性底物的酶解,測定揮發或不揮發酸,或識別是否生長等方法來分析鑒定細菌。

    使用自動化鑒定儀的局限性

    1.自動化鑒定系統是根據數據庫中所提供的背景資料鑒定細菌,數據庫資料的不完整將直接影響鑒定的準確性。目前為止,尚無一個鑒定系統能包括所有的細菌鑒定資料。對細菌的分類是根據傳統的分類方法,因此鑒定也以傳統的手工鑒定方法為金標準。使用自動化鑒定儀的實驗室,應對技術人員進行手工鑒定基礎與操作技能培訓。

    2.細菌的分類系統隨著人們對細菌本質認識的加深而不斷演變,使用自動化鑒定儀的實驗室應經常與生產廠家聯系,及時更新數據庫。實驗室技術人員應了解細菌分類的最新變化,便于在系統更新之前即可進行手工修改。

    3.通過自動化鑒定儀得出的結果,必須與其它已獲得的生物性狀(如標本來源、菌落特征及其它的生理生化特征)進行核對,以避免錯誤的鑒定。

     七、藥敏試驗和方法標準化

    準確的藥敏試驗首先要有標準的藥敏檢測試劑,包括藥敏紙片和培養基等,其次要求藥敏試驗方法的標準化。對此,我國SAST和美國NCCLS對藥敏紙片的各種抗生素含量和使用的培養基等都有嚴格的規定,要求臨床微生物實驗室必須遵循基本法則。NCCLS標準要求藥敏試驗必須使用有國內國家食品藥品監督管理局(SFDA)或美國食品藥品管理局(FDA)批準的藥敏試劑。然而,目前國內一些臨床微生物室并沒有嚴格按規定選用藥敏試紙和標準試驗方法,致使藥敏結果背離臨床實際情況,應予矯正。

    1、紙片瓊脂擴散法:紙片擴散法(K-B)選用瓊脂培養基(MHA),適合快速生長的致病菌;對于苛養菌則需使用嗜血桿菌專用瓊脂平皿(HTMA/GCA)KB法簡便、經濟,但應注意不是所有細菌都適合用該方法檢測耐藥性。發酵菌K-B法藥敏試驗只適用綠膿假單胞菌和不動桿菌屬的判斷標準,其他非發酵菌,如嗜麥芽窄食單胞菌等建議用最低抑菌濃度(MIC)法檢測耐藥性,以避免誤導臨床錯用抗生素。此外,如果考慮為多重耐藥致病菌,還需要進一步確定各種藥物的MIC,采用MIC監測,以保證臨床用藥的有效性。

    2、液體稀釋法:用于測定MIC、最小殺菌濃度(MBC)MIC50(能抑制50%試驗菌的MIC)MIC90(能抑制90%試驗菌的MIC)。液體稀釋法比較繁瑣,一般不作為常規試驗。通常用于調查罕見耐藥,調查藥敏定性試驗結果敏感,但臨床療效不佳的原因,確定中介度的敏感性,有效地選擇二線藥,評價新藥。MIC藥敏測定必須關注的是在培養基制備和測定過程中藥物的失活,在不同培養基中,因為成分和制備過程中藥物變化程度不同出現不同的MIC

    3、濃度梯度法:是一種新型的檢測細菌或真菌對抗菌藥物敏感性的方法,主要包括一個含有連續抗菌劑梯度的試條。該法與微量稀釋法具有良好的一致性,只是濃度梯度(Etest法所測MIC值普遍略高于微量稀釋法,可能與Etest法所采用的連續抗菌劑梯度,以及橢圓抑菌環內有微小菌落存在,導致終點判讀誤差所致。Etest法藥敏試驗對于探討耐藥機制,準確鑒定耐藥性,指導臨床合理使用抗生素治療,對大量使用抗生素的醫院選藥監測和對新抗生素的評價具有重要意義。

    4、聯合藥敏試驗:對臨床上病原菌不明的感染、單一藥物不能控制的混合感染、全身性綠膿假單胞菌感染、長期用藥可能產生耐藥的感染(結核、慢性骨髓炎)和病原菌為多重耐藥菌株等,宜作聯合藥敏試驗。

    5、藥敏試驗的藥物選擇:為了使藥敏試驗結果符合臨床實際需要,在我國SAST和美國NCCLS標準中,根據臨床分離的病原菌類型,對藥敏試驗的藥物選擇做了具體規定,并按最新資料每年修正公布。藥敏試驗中藥物選擇原則應根據不同菌種選擇相應的抗菌藥做藥敏,而且抗菌藥物的選擇必須合理,并經濟實用。

    藥敏試驗分析系統的基本原理是將抗生素微量稀釋在條孔或條板中,加入菌懸液孵育后放入儀器或在儀器中直接孵育,通過測定細菌生長的濁度,或測定培養基中熒光指示劑的強度或熒光原性物質的水解,觀察細菌的生長情況。在含有抗生素的培養基中,濁度的增加提示細菌生長,根據判斷標準解釋敏感或耐藥。

    當然,微生物鑒定和藥敏試驗不能完全依賴儀器,儀器使用者需要有較多豐富的傳統微生物鑒定方面的經驗,儀器與手工相結合,MICK-B相結合,取長補短,才能逐漸將微生物工作做得更好!

    下列抗生素/微生物組合在體外可出現活性,但在臨床上無效,不應報告敏感

    微生物

    不作為敏感報告的抗微生物藥

    ESBL 肺炎克雷伯菌、產酸克雷伯

    菌、大腸埃希菌和奇異變形桿菌

    青霉素類,頭孢菌素類和氨曲南

    沙門菌屬、志賀菌屬

    Ⅰ、Ⅱ代頭孢菌素和氨基糖苷類

    苯唑西林耐藥葡萄球菌屬

    所有青霉素類,頭孢類和其它β-內酰胺類,

    如阿莫西林/克拉維酸、哌拉西林/他唑巴坦和

    亞胺培南

    腸球菌屬

    氨基糖苷類(除外高濃度)、頭孢菌素類、克林

    霉素和甲氧芐啶/磺胺甲噁唑

    八、微生物實驗室在醫院感染監測中的作用

    伴隨著現代診療技術的發展,控制醫院感染已成為當前醫學發展中的重要環節。衛生部將監測和控制醫院感染的優劣列為綜合醫院分級管理標準的重要指標之一。臨床微生物檢驗人員作為醫院感染檢測和控制中一支生力軍,其作用尚未得到充分發揮,因此,加強與發揮臨床微生物實驗室的監控作用是控制醫院內感染的重要因素。

    醫院感染的監測包括:病人的準確統計、病原體和耐藥性的精確分析、消毒滅菌的質量控制、危險因素的相關分析,相關病區重點監測,醫院感染爆發流行的及時發現和控制以及病人、醫護人員和環境的消毒隔離。

    九、目前迫切需要解決的問題

    1.感染微生態學的新認識

    傳統的生物病因認為感染是由致病性微生物引起的。微生態學卻認為,感染是生態平衡與生態失調相互轉化的重要內容。引起感染的微生物不一定是致病菌或病原體,而是正常微生物群易位或易主的結果。其中的腸道正常菌群易位引起感染已引起了廣泛的關注。腸道易位的細菌主要為兼性厭氧菌,其中革蘭染色陰性桿菌占了很大一部分。通常易位的細菌與其在腸道中的數量密切相關,細菌數量越多,發生易位的可能性越大,但在正常人群,腸道內數量上占優勢的專性厭氧菌如雙歧桿菌并不發生易位。腸道細菌易位的主要原因有腸道內菌群失調,腸粘膜屏障通透性增加和宿主免疫功能下降,比如出血性休克、燒傷、外傷、腸道缺血、急性胰腺炎、嚴重感染、急性肝衰竭以及肝硬化等均可導致細菌易位。各種原因尤其在抗生素治療期間引起的腸道菌群失調,均可導致細菌易位擴散,如滅滴靈可顯著增加腸道大腸埃希菌(E coli)易位到局部淋巴結的發生率,引起腸道外的感染(膿毒血癥、肺部感染、腹腔感染等);動物實驗發現在腸道缺血再灌注時經常發生細菌易位,發生腸道易位的細菌數量依次為大腸埃希菌、變形桿菌、凝固酶陰性葡萄球菌和腸球菌。

    臨床研究發現,許多患者雖有菌血癥、膿毒血癥、全身炎癥反應綜合征或多器官功能不全綜合征(MODS)等,但沒有明確的感染灶。我們推測,腸道細菌和各種毒素易位可能參與其感染的形成和發展。

    2.厭氧菌培養

    由于諸多因素造成開展厭氧菌檢驗不廣泛、不深入。實際上臨床厭氧菌感染范圍廣、感染率高,近年資料表明,肌壞死,腹膜炎等厭氧菌感染率分別高達100%94%,如果不開展厭氧菌培養,就漏掉了感染的病原菌、延誤治療。

    3.幫助臨床合理應用抗生素

    對于耐藥菌感染,現在并沒有太多有效的治療藥物,治療的效果也不理想。例如,重癥監護和器官移植的患者中,有半數多死于耐藥菌感染而非原發疾病。臨床現在大多采用廣譜抗生素或多種藥物聯合來治療耐藥菌感染。但這可能導致更加廣泛耐藥的細菌產生。現在,由于缺乏有效的抗生素,不得不重新啟用一些因毒性太強已經被淘汰的抗生素,例如多粘菌素。
       
    抗生素的資源是有限的,濫用抗生素的趨勢如果繼續,很快就會面臨無藥可用的窘境。將回到十九世紀青霉素沒有被發現之前的時代。抗生素與耐藥菌,在自然界中就存在,并一直處于動態平衡之中。大量濫用抗生素,導致這樣的平衡被打破,細菌耐藥性也越來越強。合理使用抗生素可以大大延緩耐藥的發生。即使在細菌耐藥情況已經很嚴重的地區,合理使用抗生素之后,也可以緩解耐藥的情況。

    過去細菌學檢驗工作只注重準確的細菌學報告,不太關心臨床實際的治療效果,注重準確的細菌學結果固然重要,但這不應是我們工作的全部,檢測病原微生物對抗生素的敏感性是臨床微生物實驗室最重要的任務之一。抗生素敏感性檢測的主要目的是預測抗生素的治療效果,并幫助臨床醫生針對某一特定的臨床感染問題選擇最合適的藥物。

    近年來衛生部相繼頒布了三個文件:《醫療機構藥事管理暫行規定》,《處方管理辦法(試行)》和《抗菌藥物臨床應用指導原則》。要很好地執行這些文件,根據細菌培養和藥敏試驗結果正確選用抗生素是一個重要方面,以有效控制感染。如今抗生素已列入處方藥,醫生的責任和任務更加重大,全耐藥細菌的出現,再次敲響了抗生素耐藥的警鐘,這個警鐘不僅敲給患者,更重要的是敲給醫生聽的,如果還是算計著什么賺錢就開什么藥,那就不只是在謀財,更是在害命了。

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